Test des Cyclers

Beschreibung der PCR

Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR = polymerase chain reaction) werden aus geringen Mengen DNA  definierte Abschnitte exponentiell vermehrt. Diese Methode eignet sich besonders dazu aus unreiner, alter oder degradierter DNA spezifische Bereiche zu amplifizieren. Man kann z.B. nicht kultivierbare Bakterien nachweisen, DNA aus archaeologischen Funden untersuchen, Viren in Blut nachweisen, die DNA für einen Vaterschaftstest vermehren und vieles mehr.

Dies geschieht in vitro, also in einem Reaktionsgefäß. Die dabei verwendete hitzestabile Taq-DNA-Polymerase stammt aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Dieses Enzym synthetisiert, ausgehend von einem kurzen DNA-Doppelstrang, einen neuen DNA-Strang komplementär zum alten einzelsträngigen Matrizen-Strang (template), wobei ihr Temperaturoptimum bei 72°C liegt.

Der Ablauf der PCR besteht im Wesentlichen aus 3 Schritten, die etwa 30 Mal wiederholt werden:

  1. Denaturierung: DNA-Strang aufgeschmolzen, es entstehen Einzelstränge (94°C)
  2. Annealing: spezifische Primer (kurze Oligonukleotide) werden angelagert (je nach Sequenz: 40-60°C)
  3. Verlängerung/ Extension: Taq-Polymerase verlängert den Strang, es entsteht wieder ein Doppelstrang  (72°C)

Dadurch entstehen im Idealfall 230 Kopien der Ausgangs-DNA (bei 30 Zyklen), da die DNA-Menge bei jedem Durchgang verdoppelt wird.

Eine genauere Erklärung kann man sich bei Wikipedia ansehen: http://de.wikipedia.org/wiki/Polymerase-Kettenreaktion

oder man kann sich auf youtube auch Erklärungen anschauen:

http://www.youtube.com/watch?v=0Ue32T4_GyA

http://www.youtube.com/watch?v=NTDBsKfz50o

 Austesten eines Thermocyclers

Wenn man einen neuen Thermocycler kauft, oder eine neue PCR etabliert macht man zuerst einmal eine Test-PCR. Um die Test-PCR zu analysieren verwendet man eine DNA, an die ganz sicher die Primer binden. In unserem Fall ist das die pUC19-DNA (Ziel-DNA). Man setzt sie in verschiedenen Konzentrationen in der PCR ein und bestimmt die höchste Verdünnungsstufe, die gerade noch bei der PCR vervielfältigt wird. Dazu verdünnt man die DNA so hoch, dass in den höchsten Verdünnungsstufen die Menge nicht ausreicht um genug Amplifikat (das bei der PCR entstehende DNA-Fragment) zu ergeben.

Zur Bewertung der PCR muss beim Ansetzen immer auch eine Negativ-Kontrolle mit angesetzt werden. In diesem Ansatz sind zwar alle benötigten Chemikalien, aber keine DNA. Dieser Ansatz muss negativ sein, also es darf kein Amplifikat entstehen. Sollte ein Amplifikat auf dem anschließend durchgeführten Agarosegel sichtbar sein, dann lässt das darauf schließen, dass in einer der verwendeten Chemikalien oder in einer der verwendeten Gerätschaften Ziel-DNA war, die versehentlich in den Ansatz geraten ist.

Normalerweise braucht man auch eine Positiv-Kontrolle, die in diesem Fall aber nicht gebraucht wird, weil die pUC19-DNA  in den niedrigeren Verdünnungsstufen sicher positiv sein muss und sozusagen die Positiv-Kontrolle darstellt. Das Plasmid pUC19 besitzt zu den Primern komplementäre Bereiche, so dass die Primer auf alle Fälle binden und bei der PCR ein Amplifikat entstehen muss. Dieses Amplifikat ist 491bp lang.

Durchführung des Tests:

Material:               – Primer:pUCrev-185: 5’ AATGCAGCTGGCACGACAG 3’

pUCseq-252: 5’ TATGCGGCATCAGAGCAG 3’

– pUC19 DNA (0,25 µg/µL)

– Mastermix: PCR-Mastermix Y (PeqLab) oder 2x PCR-Mastermix (Fermentas)

 

Geräte:                  Thermocycler

Zentrifuge

kleine Eppendorfcaps

Kolbenhubpipette und PCR-Pipetten (Kolbenhubpipetten,

ohne Verunreinigung mit pUC19)

Pipettenspitzen (gestopfte und ungestopfte)

 

Benutzung der Pipetten: die PCR-Pipetten und gestopfte Pipettenspitzen werden für alle Pipettiervorgänge außer zum Pipettieren der DNA benutzt. Also es wird das Wasser für die Verdünnungen, und das Wasser, Primer und der Mastermix für den PCR-Ansatz mit den PCR-Pipetten pipettiert. Die DNA selbst wird mit normalen Pipetten und Pipettenspitzen pipettiert.

Durchführung:

  • Verdünnen der DNA:  pUC19  – 1:100, 1:104, 1:106, 1:107, 1:108, 1:109,  1:1010, 1:1011, 1:1012
  • Herstellen des Primer-Mastermix: man benötigt für jeden Ansatz die unten aufgeführten Mengen. Diese Substanzen werden zusammengegeben (für 1 Ansatz mehr als nötig) und gut vermischt:

1,25 µl 20 µM Primer pUCrev-185

1,25 µl 20 µM Primer pUCseq-252

21,5µl H2O

25,0µl Mastermix

  • Ansatz:                                     1µl DNA bzw. H2O

49 µl Mega-Mastermix

 

 

PCR-Programm

Deckelheizung: 110°C, vorgheizt

2 min 94°C                          (Startdenaturierung)

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15 sec 94°C                         (Denaturierung)

15 sec 45°C                         (Annealing)                                          25 Zyklen

45 sec 72°C                         (Verlängerung)

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2 min 72°C                          (Verlängerung)

Lagerung der DNA: 10°C

 

 

Die entstandene DNA wird anschließend auf einem Agarosegel analysiert. Tragen Sie jeweils 15µl der PCR auf dem Gel auf.

 

Auswertung:

Welches Ergebnis erwarten Sie bei den einzelnen Ansätzen? Warum? Nachdem Sie die Ansätze auf dem Agarosegel überprüft haben, vergleichen Sie, ob die Erwartungen mit den tatsächlichen Ergebnissen übereinstimmen? Wenn nicht, was könnte der Grund sein?

 

Die folgenden Fragen kann man beantworten, um die PCR noch genauer zu verstehen.

Fragen:

1. Sie haben neue Primer bestellt. Sie kommen in Labor an und sind mit der Konzentrationsangabe 100 pmol/µl beschriftet. Können Sie die Primer so, wie sie sind verwenden, oder müssen Sie verdünnt werden? Um diese Frage zu beantworten, finden Sie zuerst heraus, wie hoch die Konzentration ist, mit der sie die PCR-Reaktion durchführen sollen. Berechnen Sie dann, wie Sie die gekauften Primer behandeln sollen.

2. Bei einer PCR ist die Negativ-Kontrolle positiv, d.h. dort wurde ein Amplifikat entdeckt. Was lässt sich daraus schließen? Was bedeutet dieses Ergebnis für die übrigen Ergebnisse der PCR?

3. Wenn Sie ein einziges pUC19 Moleküle in Ihrem Ansatz haben, wie viele Amplifikate hätten Sie dann nach der Amplifikation im Optimalfall (also, wenn wirklich bei jedem Zyklus die Anzahl an DNA-Fragmenten verdoppelt wurde)?

4. Wie viele DNA-Moleküle haben Sie in Wirklichkeit im Ansatz vor der Amplifikation? Das können Sie berechnen, indem Sie das Molekulargewicht von pUC19 berechnen (ein Nukleotid wiegt durchschnittlich 330 g/mol) und dann die Anzahl an Molekülen mit Hilfe der bekannten Konzentration der DNA-Lösung berechnen.

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