Zur besseren Beobachtung unter dem Mikroskop können MO angefärbt werden. Hierdurch wird der Kontrast erhöht, verschiedene Bakteriengruppen können aufgrund ihres Färbeverhaltens differenziert werden (GRAM- Färbung) oder bestimmte Strukturen (Geißeln, Sporen) können dargestellt werden. Bakterienzellen können entweder noch lebend angefärbt werden (=Lebendpräparat, s. einfaches Deckglaspräparat) oder sie werden vor der Färbung auf dem Objektträger ausgestrichen und fixiert (s.u.), d.h. sie müssen strukturschonend abgetötet werden, da sie in dieser Form besser einzufärben sind. I.d.R. werden MO hitzefixiert. Nach der Fixierung stehen verschiedene Färbemethoden zur Verfügung. Die gefärbten Präparate können mit Entellan eingedeckt werden.
Vorbereitung der Mikroorganismen zum Mikroskopieren:
1. Herstellen von Ausstrichen (für Färbepräparate):
- Objektträger gründlich entfetten (Geschirrspülmittel, Alkohol) und trocknen
- Dünne Bakteriensuspension herstellen; dies kann direkt auf dem Objektträger erfolgen; hierzu einen Tropfen Leitungswasser mit der Öse auf den OT setzen und mit einer Impföse wenig Bakterienmaterial von der Petrischale hinzugeben, dann Wasser und Bakterien mit der Impföse vermischen und zu einem dünnen Film ausstreichen (bildet sich ein Tropfen, ist der Objektträger nicht fettfrei); Bakteriensuspension aus Bouillon wird direkt verwendet.
- An der Luft trocknen lassen, hier kann das Trocknen ggf. mit einem Haartrockner vorsichtig beschleunigt werden, allerdings darf der Objektträger hierbei nicht heiß werden!
2. Hitzefixierung
Den getrockneten Ausstrich (s.o.) mit einer Holzzange festhalten und 3 x – nicht zu schnell – mit der Ausstrichseite nach oben durch eine prasselnde, entleuchtete Brennerflamme führen, dabei darf jedes Mal in etwa 2 sec einen senkrechten Kreis von etwa 20 – 30 cm Durchmesser gleichmäßig durchlaufen; der Ausstrich darf nicht verbrennen.
3. Färben
- Färbebank waagerecht ausrichten
- Objektträger mit der Ausstrichseite nach oben auf die Färbebank legen
- Jeweilige Färbemethode anwenden
4. Mikroskopieren
Es wird entweder ein hitzefixierter, gefärbter Ausstrich oder ein Lebendpräparat verwendet
- zunächst mit einer kleinen Vergrößerung (100x oder 400x) eine geeignete Stelle im Präparat suchen und scharf stellen
- dann benutztes Objektiv aus dem Strahlengang herausschwenken und das Ölimmersionsobjektiv in Richtung des Strahlengangs schwenken, aber noch nicht in den Strahlengang bringen
- jetzt Immersionsöl auf den Präparatausschnitt (Lichtfleck) geben (auf das Deckglas oder bei gefärbten, hitzefixierten Ausstrichen direkt – ohne Deckglas – auf den Ausstrich)
- anschließend unter Beobachtung von der Seite das Ölimmersionsobjektiv in den Strahlengang bringen, dabei taucht die Frontlinse in den Öltropfen ein
- erst jetzt in das Okular blicken und mit dem Feintrieb das Objekt scharf stellen, dabei muss das Objektiv im Öl eingetaucht bleiben; bei Ölimmersionsobjektiven sind wegen des sehr geringen Abstandes zwischen Frontlinse und Objekt besondere Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, da Kollision droht; außerdem dürfen die übrigen Mikroskopteile (weitere Objektive, Objekttisch, Kondensor) nicht mit Öl in Berührung kommen und müssen ggf. sofort von dem Öl befreit werden
- nach dem Mikroskopieren Ölimmersionsobjektiv und ggf. weitere Mikroskopteile gründlich säubern
Färbemethoden:
Hier fehlt das Bild der Färbebank, Videos sind für die einzelnen Methoden zu ergänzen, Beispielbilder von positiven und negativen Färbeergebnissen von Präparaten fehlen
Übersichtsfärbung mit Safranin
Färbelösung = Safranin 1%ig in dest. Wasser (s. Sporenfärbung)
- Hitzefixierten Ausstrich herstellen
- Färbebank waagerecht ausrichten
- Objektträger mit der Ausstrichseite nach oben auf die Färbebank legen
- Ausstrich vollständig 1-2 min mit Safranin bedecken
- mit Leitungswasser vorsichtig (von der Rückseite aus) spülen bis keine Farbwolken mehr ablaufen, dabei die Färbebank kippen, so dass das Wasser auch ablaufen kann
- Mit Ölimmersion mikroskopieren
Übersichtsfärbung mit Methylenblau nach Löffler
Färbelösung = Methylenblau nach Löffler; 30 ml gesättigte alkoholische Stammlösung von Methylenblau und 70 ml 0,01%ige KOH
- Hitzefixierten Ausstrich auf der Färbebank vollständig mit Methylenblau bedecken
- Nach 2-5 min mit Leitungswasser spülen, dabei die Färbebank kippen, so dass das Wasser auch ablaufen kann
- Kurz mit dest. Wasser nachspülen und trocknen lassen
- Mit Ölimmersion mikroskopieren
Zellwandfärbung nach GRAM
Die Färbung nach GRAM ist ein wichtiges Hilfsmittel beim Identifizieren von Bakterien. Bei der Färbung wird in der Zellwand der Bakterien ein Farblack gebildet, der sich je nach Aufbau der Zellwand wieder herauslöst (=Gram- negativ) oder nicht (=Gram- positiv = blau). Die gramnegativen Bakterien können mit Safranin gegen gefärbt werden und erscheinen dann rot. Wenn möglich gibt man zur Färbung auf den Objektträger mind. 1 Keim, dessen Färbeverhalten man kennt (z.B. E. coli, gramnegativ; M. luteus, grampositiv) und den Keim, dessen Färbeverhalten man noch nicht kennt.
Färbelösungen = Kristallviolett und Safranin (fertige Lösungen der Firma Merck)
Lugol´sche Lösung: 2 g KJ in wenig dest. Wasser lösen, 1 g Jod in dieser Lösung lösen und auf 300 ml auffüllen
Entfärbelösung: ca. 80% iges Ethanol früher:(1 Teil Ethanol (96%) + 1 Teil Aceton)
- Hitzefixierten Ausstrich auf Färbebank mit Kristallviolett bedecken und 3 min einwirken lassen
- Objektträger schräg stellen , Farbstoff ablaufen lassen
- Ausstrich mit Lugolscher Lösung bedecken und 2 min einwirken lassen und abgießen
- OT schräg stellen und evt. kurz mit Wasser spülen
- Anschließend mit Entfärbelösung spülen bis sich keine Farbwolken mehr lösen (Vorgang soll evt. nicht länger als 20 s dauern) OT kann dabei in ein Becherglas/ Küvette gestellt werden
- kurz mit Leitungswasser spülen
- zur Gegenfärbung OT mit Safranin für 2 min bedecken
- mit Wasser abspülen trocknen lassen
- mit Ölimmersion mikroskopieren
Sporenfärbung nach Wirtz
Verschiedene Bakteriengruppen können Sporen, sogenannte Endosporen, bilden. Diese Sporen haben besondere Eigenschaften (z.B. säurefest, hitzeresistent) und dienen zur Überdauerung ungünstiger Lebensbedingungen. Die Sporen können während der Sporulation angefärbt werden. Sporen entwickeln sich nach ca. einer Woche auf festem Agar – nicht aber in Flüssigbouillon. (die Keime können auf Sporulationsnährboden angezüchtet werden.)
(Sporulationsmedium: Pepton 5g, Fleischextrakt 3g, MnS04xH2O 10 mg, Agar 15 g ad 1l dest. Wasser pH 7,0)
Färbelösungen = Malachitgrün (5 %ig in dest. Wasser) und Safranin- Lösung (1%ig in dest. Wasser)
- Hitzefixierten Ausstrich auf Färbebank mit frisch filtrierter Malachitgrün bedecken
- 15 min einwirken lassen – Farbstoff nicht eintrocknen lassen!
- vorsichtig mit Leitungswasser abspülen bis der gesamte Farbstoff entfernt ist
- für 4-5 min in ein Becherglas mit Leitungswasser stellen
- 5 min mit Safranin gegenfärben, abspülen, trocknen lassen
- mit Ölimmersion mikroskopieren
Sporen sind grün angefärbt in einer rot gefärbten vegetativen Zelle.
Nativpräparat
Mikroorganismen können auch ungefärbt als Nativpräparate (Deckglas- Flüssig- Präparat) beobachtet werden. Die Morphologie wird nicht durch Färbungen beeinflusst, da die Bakterienzellen dadurch häufig aufquellen. Außerdem können so die Anordnungen von Bakterien und die Beweglichkeit besser und schnell beobachtet werden. Es dient einer ersten Orientierung über Größe, Form, Anordnung und Fortbewegung der Zellen.
Material aus einer flüssigen Kultur kann direkt auf den Objektträger gebracht werden, Kolonien von festen Nährmedien müssen vorher mit Wasser oder Saline suspendiert werden.
Durchführung:
- Objektträger entfetten und trocknen
- Impföse ausglühen und abkühlen lassen
- Ein bis drei Ösen Material auf einen Objektträger geben evt. mit Wasser oder Saline verdünnen und nicht ausstreichen; das Material darf nicht antrocknen, Öse ausglühen
- Deckglas schräg an den Tropfen aufsetzen und vorsichtig absenken; dabei sollte das Präparat nicht über den Deckglasrand reichen; Öl auf das Deckglas aufbringen
Das Präparat ist sehr kontrastarm und erfordert einige Übung beim Mikroskopieren. Zunächst mit dem starken Trockensystem die Ebene suchen, dann mit Ölimmersion mikroskopieren und zeichnen. Das Präparat benötigt weniger Licht als gefärbte Ausstriche, dazu also Beleuchtung reduzieren und den. Kondensor absenken.