Physiologische und biochemische Merkmale

Physiologische und biochemische Merkmale

Verwertung von Kohlenhydraten

Wenn ein Zucker dem MO als C- Quelle dienen kann, so wird er in die Zelle aufgenommen und durch Enzyme umgesetzt. Die Art der Endprodukte ist von der enzymatischen Ausrüstung des Organismus und den Versuchsbedingungen abhängig.

Bakterien, die Sauerstoff verwerten können und den Zucker um Rahmen der Zellatmung abbauen, produzieren als Endprodukte dieses Stoffwechselprozesses CO2 und H2O.

Aerob:    Zucker  ->    CO2  +  H2O   (obligat aerobe MO, fakultativ anaerobe MO = Opportunisten)

MO, die keine Zellatmung durchführen, weil sie Sauerstoff nicht nutzen können, vergären den Zucker (=Fermentation). Es entstehen Fermentationsendprodukte wie z.B. H2, CO2, Essigsäure, Ameisensäure oder Milchsäure, die nach außen abgegeben werden. Die Säureproduktion führt zu pH-Veränderungen im Nährboden. Diese pH- Veränderung kann man durch einen pH- Indikator im Nährboden sichtbar machen. Die Gasbildung kann durch Auffangen des Gases in Durham Glasröhrchen nachgewiesen werden.

Anaerob:  Zucker  ->  organische Säuren + CO2  +  H2 (aerotolerante fakultativ  anaerobe MO o.  obligat anaerobe MO)

Hierbei ist zu berücksichtigen, dass es einerseits Bakterien gibt, die in Gegenwart von O2 wachsen können, O2 aber nicht nutzen (=aerotolerante fakultativ anaerobe MO) und andererseits Bakterien existieren, die ihren Stoffwechsel je nach Vorhandensein von O2 von Gärung auf Atmung umstellenkönnen (fakultativ anaerobe MO = Opportunisten). Außerdem gibt es Keime, die für die O2 giftig ist. Diese Keime können den Sauerstoff nicht nutzen und können nur in O2 – freier Umgebung leben (obligat anaerobe MO).

Es fehlen Abbildungen zu Stoffwechselwegen und -typen.

Nachweis des oxidativen bzw. fermentativen Abbaus von Zuckern (Oxidations- Fermentations- Test = OF- Test):

Mit diesem Test kann überprüft werden ob von einem Keim in Gegenwart von O(oxidativ) o. in Abwesenheit von O2 (fermentativ) Zucker zu Säuren vergoren werden. Bietet man dem Keim verschiedene Zucker an, kann auch festgestellt werden, welche Zucker verwertet werden. Hier wird dem Nährboden der Zucker Glucose zugesetzt. Die mögliche pH- Verschiebung wird durch den Indikator Bromthymolblau (bei pH 7,5 blaugrün, unter pH 6,0 gelb) im Nährboden angezeigt.

Indikatornährboden:

Pepton aus Casein 2 g
Hefeextrakt 1 g
NaCl 5 g
K2HPO4 0,3 g
Glucose 5  g    (könnte durch andere Zucker ersetzt werden)
Bromthymolblau- Stammlösg. 10 ml
Agar agar 25 g
dest. Wasser ad.     1 l         pH 7,0

Bromthymolblau- Stammlösung:  180 mg Bromthymolblau in 100 ml 20 mM NaOH- Lösung geben; je ml werden i.d.R. 0,01 ml Stammlösung zugegeben

Durchführung: pro Bakterium werden 2 Kulturröhrchen mit je ca. 10 ml Indikatornährboden gefüllt, autoklaviert und nach dem Abkühlen durch Stichimpfung bis auf den Röhrchengrund mit dem MO beimpft. In eines der beiden Röhrchen wird nach dem Beimpfen zusätzlich unter sterilen Bedingungen  3 ml warmer, flüssiger Wasser-Agar gegeben (anaerobe Bedingungen). Beide Reagenzgläser werden 3 Tage bei 30°C bebrütet (inkubiert).

 

Auswertung: Reagenzgläser auf Wachstum und Farbumschlag prüfen. Es sind folgende Ergebnisse möglich

Abbildungen / Bilder zu Ergebnissen der unterschiedlichen, charakteristischen Ausprägungen

Untersuchung auf Säure und Gasbildung aus verschiedenen Zuckern (hier nur Glucose):

 

Der Test gibt Auskunft darüber ob ein MO beim Abbau des Zuckers neben Säure auch Gas bildet.

Nährlösung:

Pepton aus Casein 10g
Fleischextrakt 1 g
Glucose 5 g
Bromthymolblau- Stammlsg. 10 ml
Dest. Wasser ad     1 l          pH 7,5

Durchführung:

Pro Bakterium ein Kulturröhrchen mit 10 ml Nährlösung befüllen und ein Durham- Röhrchen mit der Öffnung nach unten in das Röhrchen stellen, autoklavieren (Luftblase im Durham-Röhrchen verschwindet dann, es füllt sich mit Nährlösung) und nach dem Abkühlen mit dem MO beimpfen (Impföse) . Kulturröhrchen bei 30°C 3 Tage inkubieren.

Auswertung: Röhrchen auf Farbumschlag (gelb= positiv) und Gasbildung (Gasblase im Durham-Röhrchen = positiv) überprüfen.

Abbildung Durham-Röhrchen / Durham-Röhrchen mit Gas

Nachweis bestimmter Enzyme

Katalase Nachweis

Bei aerobem Wachstum entsteht im Stoffwechsel Wasserstoffperoxid (H2O2). Die aeroben MO spalten dieses Zellgift mittels eines besonderen Enzyms, der Katalase. Obligat anaeroben Bakterien fehlt dieses Enzym. Dies ist wahrscheinlich der Grund für ihre anaerobe Lebensweise. Auch Milchsäurebakterien besitzen keine Katalase, sie können aber mit O2 wachsen, da sie ein anderes Enzym zur Entgiftung besitzen. Daher ist ein Keim, der unter aeroben Bedingungen wächst, aber keine Katalase besitzt, höchstwahrscheinlich ein Milchsäurebakterium.

Reagenzien: Wasserstoffperoxidlösung 3%ig (frisch ansetzen!)

Durchführung: von allen verwendeten Keimen 1Tag – 1 Woche vor Versuchstermin einen einfachen Ausstrich auf FPA herstellen und bebrüten. Nach der Bebrütungszeit 1 Tropfen der Wasserstoffperoxid- Lösung auf eine gewachsene Kolonie des zu testenden MO geben.

Auswertung: wenn die aufgetropfte Wasserstoffperoxid- Lösung aufschäumt, wird durch ein Enzym (wahrscheinlich Katalase) des MOs O2 aus dem H2O2 produziert, damit ist der betreffende Organismus Katalase- positiv

Cytochromoxidase Nachweis

Mit Hilfe eines Teststäbchens wird die Anwesenheit des Warburgschen Atmungsferments, die Cytochromoxidase C überprüft. Durch Auftragen einer Kolonie mit einer sterilen Öse auf das angefeuchtete Testfeld färbt sich dieses dunkelviolett (positiv) oder nicht.

Vereinfachte Bestimmungsverfahren  (Schnelltests)

Identifizierung mit Bactident E. coli

Stellen Sie die von E. coli und einem anderen Keim mind. Eine Woche vor dem Versuch einen fraktionierten Ausstrich auf FPA her und verwenden Sie die gewachsenen Kolonien für den Test. Weiteres Vorgehen s. Kopie „Gebrauchsanweisung Bactident“.

Identifizierung eines Keims mit der Enterotube (Multiagarsystem)

Überprüfen Sie Keime von einer vermeintlichen E. coli-Platte (s.o.) mit der Enterotube auf ihre Identität. (s. Gebrauchsanweisung „Enterotube“ . E. coli zählt zu den Enterobacteriaceae und ist oxidasenegativ.

Verwendete Keime:

  1. coli (gramnegativ, kleine kokkoide Stäbchen, beweglich, Lactose positiv, fakultativ anaerob, Oxidase negativ, fermentativ (OF) Säure bildend)
  2. Bacillus spec. (grampositive große Sporen bildende Stäbchen, aerob, beweglich, Oxidase negativ, Katalase positiv)
  3. Micrococcus luteus (grampositive Kokken, aerob, Oxidase negativ, unbeweglich, bildet gelbe Pigmente)
  4. Pseudomonas fluorescens (gramnegative, schlanke, nicht Sporen bildende Stäbchen, aerob, Cytochrom-Oxidase positiv, Oxidativ (OF) Säure bildend, Bildung div. fluorescierender Pigmente)

 

Aufgabe:

Identifizieren Sie einen Stamm Ihrer Wahl.
Führen Sie dazu alle morphologischen und biochemischen Verfahren aus, die im Script beschrieben sind.
Alle mikroskopischen Arbeiten müssen anhand einer Skizze und evt. einer Fotografie dokumentiert werden.
Evt. auch Fotografien der biochemischen Tests.
Die Skizzen müssen von der Laborleitung abgezeichnet werden.
Stellen Sie Ihre Ergebnisse anhand einer Tabelle s. u. dar.

Zur Durchführung muss pro Stamm folgendes vorbereitet werden:

  • eine Glucose-Bouillon  à 10 ml mit DurhamRö
  • zwei Indikatornährboden-RG zur Stichbeimpfung à 10 ml
  • ein kleines RG mit 3 ml Wasser-Agar
  • 4 Platten FPA
  • 4 RG FP-Bouillon à 10ml

Beispiel:  Ergebnisse  Block 2   Identifizierung

Keim A Keim B Keim C Keim D
Form (monochrom. Färbung) Lange Stäbchen
GRAM- Färbung Positiv
Sporenfärbung Positiv
Beweglichkeit Negativ
Oxidase- Test Negativ
Säurebildung aus Glucose  Positiv
Gasbildung Negativ
OF- Test Fermentativ pos
Katalase- Test Neg
Bactident- Test Neg
(Enterotube) Entfällt
Wahrscheinlicher Name Bacillus spec

Quantitative Ermittlung von Keimen

Die quantitativen Methoden dienen dazu, die Individuenzahl bzw. ihre Konzentration oder Biomasse in einer Kultur zu erfassen. Hierbei muss man sich bewusst sein, dass es sich um eine „Momentaufnahme“ eines Gefüges von Lebewesen handelt, in dem durch Vermehrung und durch Absterben von Zellen ständige, oft sehr starke Veränderungen innerhalb kürzester Zeit eintreten können. Die Proben müssen daher sofort nach Entnahme aus der Kultur bestimmt oder zumindest (für kurze Zeit) gekühlt werden.

Die Tabelle unten fasst zahlreiche quantitative Bestimmungsmethoden zusammen. Im Praktikum werden Sie einige der Verfahren kennen lernen.

Übersicht über die wichtigsten Methoden zur quantitativen MO – Bestimmung:

I. Kulturverfahren (Zählung gewachsener Kolonien, auf Nähr- oder Differenzierungs- Agar)

1.a) Plattenguss nach KOCH
b) Zweischichtenguss

2. Ausstrich
3. Ausspatelung
4. Eintauch- (Strip) Verfahren
5. Membranfiltermethoden
6. MPN- Verfahren

 

II. Direkte (absolute) Keimzählung

1. Zählkammer nach Thoma
2. gefärbtes Ausstrichpräparat
3. gefärbtes Anreicherungspräparat (Membranfilterpräparat)
4. Partikelzählung m. Coulter Counter
5. Besiedelungs- Methoden
6. Dünnschliff- Methoden

III. Physikalische Verfahren

Impedanz-Messung

Photometrische Methoden (optische Dichte)

  1. Streulichtmessung
  2. Absorptionsmessung

1.  Gravimetrische Methoden

  1. Feuchtmasse
  2. Trockenmasse

IV. Biochemisch- analytische Verfahren

Proteinbestimmung

  1. Gesamtstickstoff- Bestimmung
  2. Gesamtkohlenstoff- Bestimmung
  3. Isotopen- Einbau
  4. Restsubstrat- Bestimmung
  5. Pyruvat- Bestimmung

V. Keimzahlermittlung aus dem chemischen Umsatz in einer Kultur

  1. pH- Messung
  2. Atmungsmessung (O2– Verbrauch)
  3. CO2– Produktion
  4. Enzym- Aktivitäten
  5. DNA-Bestimmung

Kulturverfahren: hierbei wird die Keimzahl durch Auszählung der auf Nähr- oder Differenzierungsagar gewachsenen Einzelkolonien bestimmt. Es wird vorausgesetzt, dass sich jede lebende Zelle (=KBE = Kolonie bildende Einheit oder CFU = Colony forming unit) zu einer Kolonie entwickelt. Da bei diesen Verfahren inaktive und tote Zellen nicht berücksichtigt werden (sie wachsen nicht zu Kolonien aus), handelt es sich um eine reine Lebendkeimzahlbestimmung (Keimzahl). Bei Mischkulturen erfolgt durch die Wahl der Züchtungsbedingungen (Nährboden, Temperatur, u.a.) zwangsläufig eine Selektion unter den verschiedenen MO, so dass die Ergebnisse sich nur auf die selektierten Keime beziehen. Dagegen erhält man mit diesen Zähltechniken ausgezeichnete Ergebnisse bei der Arbeit mit Reinkulturen.

Bei der Trinkwasseruntersuchung in LINK wird die Keimzahlbestimmung mittels Membranfiltration durchgeführt.

Direkte Keimzählung: zu diesen Verfahren gehört das Auszählen von Zellen in der Thoma- Kammer. Alle direkten Verfahren erfassen gleichermaßen lebende, inaktive und tote Zellen. Es wird also die Gesamtpartikel- oder Zellzahl bestimmt. Durch entsprechende Färbungen könnte zwischen lebenden und toten Zellen differenziert werden.