Reinkultur und Vereinzelungsausstriche

2.6 Anlegen einer Reinkultur / Vereinzelungsausstriche

Mikroorganismen kommen überall vor. Sie kommen als gemischte Populationen vor. Veränderungen des normalen Lebensraumes (verändertes Nahungsangebot, Temperatur- pH- Wertschwankungen) so ändern sich durch die veränderten Wachstumsbedingungen auch die Spezies der dominierend wachsenden Mikroorganismen. Die am besten angepassten wachsen schneller als andere (überwachsen andere) und reichern sich in dem Lebensraum an; die Bakterienflora hat sich verändert.

Mikroorganismen können auch unter Laborbedingungen durch definierte Wachstumsparameter selektiert werden. Hierzu muss man die physiologischen und ökologischen Ansprüche kennen. Das gezielte Variieren von Milieufaktoren wie Nährstoffangebot, Temperatur, Belüftung, pH- Wert, Licht u.a. spielt eine entscheidende Rolle. Man bezeichnet eine Kultur, die die Zusammensetzung einer von Natur aus gemischten Population so verändert, dass schließlich der gewünschte Keim dominiert, als Anreicherungskultur.

Aus der Anreicherungskultur kann mittels besonderer Reinigungstechniken, die die Trennung verschiedener Mikroorganismen (gewünschter von ungewünschten) bewirken, eine Reinkultur (Klon s.u.) angelegt werden.

Mischkultur ->  Anreicherungskultur -> Reinigung -> Reinkultur

Grundlage für die Reinkultur ist erstens zunächst die Vereinzelung von Mikroorganismen auf einem Nährboden und zweitens die von diesen Zellen ausgehende Entwicklung isoliert liegender Kolonien. Hierbei handelt es  sich in der Regel um Reinkulturen, da die am Kolonieaufbau beteiligten Zellen aus einer einzigen Zelle hervorgegangen sind und somit einen Klon (= erbgleiche Nachkommenschaft) darstellen. Als Reinkultur bezeichnet man also eine Kultur, die aus der Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle besteht.

Zur Reinigung der Anreicherungskultur werden folgende Verfahren angewandt:

1. Fraktionierte Ausstriche / Vereinzelungsausstriche:

  1. Drei- Strich- Ausstrich
  2. Kreuzausstrich
  3. 13-Strich-Verfahren

 

zu 1a) Drei- Strich- Ausstrich:

  • mit einer ausgeglühten und abgekühlten Impföse wird etwas Material von einer Kolonie abgenommen und diese in einem Tropfen sterilen Wasser o. Saline (zweckmäßigerweise im Deckel oder Boden einer sterilen Petrischale oder Kulturröhrchen) verrieben und möglichst gleichmäßig suspendiert; die Zelldichte sollte so hoch sein, dass eine deutliche Trübung des Wassertropfens erkennbar ist.
  • Dann wird die Impföse mit der MO- Suspension benetzt und auf einer Nährbodenplatte werden am Rand 3 parallele Impfstriche ausgeführt (A)
  • Dann wird die Impföse wieder ausgeglüht, abgekühlt und nach Drehen der Petrischale nach links werden nochmals 3 parallele Impfstriche (B) ausgeführt; diese Impfstriche müssen so ausgerichtet sein, dass die Anfänge der Impfstriche die Enden der vorher ausgeführten Impfstriche überkreuzen; allerdings sollten nur A1 mit B1, A2 mit B2, und A3 mit B3 überkreuzen
  • Dieser Vorgang wird noch 2 x (C und D) wiederholt mit zwischenzeitlichem Ausglühen der Impföse; auf diese Weise werden mit jedem Impfstrich immer weniger MO verschleppt, so dass die Keime auf dem letzten Impfstrich (D3) einzeln vorliegen und zu einer Kolonie heranwachsen

Zu 1b)  Kreuzausstrich

  • man stellt sich wieder eine MO- Suspension her (s.o.) und nimmt einen Teil davon mit einer ausgeglühten und gekühlten Impföse auf
  • mit der Impföse wird dann ein langer Impfstrich quer über die ganze Platte ausgeführt (A)
  • jetzt wird die Impföse wieder ausgeglüht und abgekühlt
  • anschließend wird ein langer, schlangenförmiger Impfstrich (B) angelegt, der mit jeder Schlaufe den 1. Impfstrich kreuzt
  • am Ende des Impfstriches sollten die Keime ebenfalls vereinzelt vorliegen.

Zu 1c)  13 – Strich-Verfahren

  • Vorgehensweise wie unter 1a
  • es wird bei der letzten Impfstrichanordnung D ein zusätzlicher 4. Impfstrich ausgeführt, der parallel zu D1-3 verläuft, aber nicht die Impfstriche von C kreuzt

2.  Ausspateln in fallender Reihe

  • man stellt 3 Agarplatten her und trägt auf die erste Platte sehr wenig MO-Material mit der Impföse oder –nadel auf; aus einer flüssigen Kultur bringt man ebenfalls eine Impföse voll Material oder 0,1 ml auf
  • dann das Material mit einem sterilen Drigalski-Spatel auf der Agaroberfläche gleichmäßig verteilen, indem man den Spatel mit seiner ganzen Breite radial vor- und zurückbewegt und dabei die Platte gleichzeitig dreht (ca. 30 sec.); die Agaroberfläche hierbei nicht verletzen
  • anschließend noch ohne zwischenzeitliches Abflammen auf der 2. und dann auf der 3. Platte ausspateln

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