Zellkulturleitsätze

Die Ausrüstung von Zellkulturlaboratorien muss unterschiedlichen Ansprüchen genügen. Zu diesen Ansprüchen gehört neben der chemischen und physikalischen Sicherheit auch die biologische Sicherheit. Entsprechende Schutzklassen und -regeln sollen eine dem angestrebten Sicherheitsniveau angemessene Arbeitsweise und Handhabung regeln. Zu dem Schutz der handelnden Personen, der Umwelt und Dritter tritt der Schutz / die Sicherheit der zu handhabenden Zellen.

Sicherheitsfragen und Fragen der angemessenen technischen wie auch personellen Kompetenz sind vor der ersten Handhabung / bei der Planung des Labors und der in diesem durchzuführenden Arbeiten zu klären.

  • Welche Risiken gehen von den Arbeiten / Zellen für die handhabende Person aus?
  • Wie lassen sich diese Risiken minimieren?
  • Gibt es Faktoren, die zu einer Risikovergrößerung im Zuge durchgeführter Tätigkeiten entstehen können? (Transformation von Zellen, gemeinsame Handhabung transfizierter und nicht transfizierter Zellen, genetische Veränderungen durch Kulturbedingungen und Dauer, Einschleppungen durch fremde Zelllinien, Medien, Gebrauchsstoffe ….)
  • Lagerung und Entsorgung gehören zu Zellkulturarbeiten ebenso wie Wechsel von HEPA-Filtern, Reinigung und Überprüfung von Geräten. Welche Maßnahmen berücksichtigen diese Risiken?
  • Zusätzliche entstehen Risiken für Arbeitsergebnisse, was insbesondere fatale Auswirkungen hat, wenn diese Ergebnisse Risikoeinschätzungen beeinflussen. Die zusätzlichen Risiken können beispielsweise in Kontaminationen, Fehlidentifikationen von Zellen liegen. Ausschluss von „Kontamination“ ist ein wesentlicher Punkt der guten Zellkulturpraxis.

Zu Beginn von Arbeiten mit Zellen sind Richtlinien zum korrekten Umgang und zur eindeutigen Identifikation von gehandhabten Zellen und den sicheren Ausschluss von Kontaminationen zu fixieren. Eine erprobte Basis bilden die folgenden Leitsätze:

  • Beginne niemals Zellkulturarbeiten, bevor Du nicht sicher bist, dass alles benötigte Material (inklusive der Geräte, Medien, Verbrauchsmaterial, Durchführungsvorschriften) vorhanden, verfügbar, eindeutig identifiziert/identifizierbar und einwandfrei ist.
  • Zu Desinfektionszwecken wird viel Alkohol verwendet. Dieser ist in den verwendeten Konzentrationen brennbar und kann mit Luft explosive Gemische bilden!
  • Kontaminationsverhinderung geht über die Reinhaltung und Behandlung der Arbeitsflächen hinaus und fordert ein planvolles Regime.
  • Die vorgesehenen Luftmengen müssen stets und unbeeinträchtigt und ohne Verunreinigung strömen können.
  • Offene Materialien, Vorrichtungen die zu Stauungen des Luftstroms führen können, wie geschlossene Vertiefungen in beispielsweise Ständern sind im Sterilbereich zu vermeiden.
  • Verunreinigungen und Schmutz befinden sich nicht nur AUF den Dingen im Sterilbereich, sondern auch AN ihnen, UNTER ihnen oder auf ihrer Unterseite.
  • Für saubere Oberflächen aller in den Sterilbereich einzubringenden Dinge ist vor deren Einbringung zu sorgen
  • Sterile Arbeitsumgebungen benötigen in der Regel einige Zeit für ihre Entstehung. Entsprechende Vorlaufzeiten sind zu planen. (Reinraumwerkbänke benötigen mindestens 5 Minuten oft aber auch mehr bis sich in ihrem Arbeitsraum eine Reinraumatmosphäre etabliert hat.) Erforderliche Mindestzeiten hängen von Luftwechselraten, Öffnungsweiten, Zuluftregime und weiteren Aspekten ab und sind zu verifizieren.
  • Habe nur die Dinge im Sterilbereich, die Du wirklich benötigst.
  • Entstehende Abfälle sind meist mögliche Kontaminationsquellen. Sie verlangen einen überlegten Umgang im und außerhalb des Sterilbereichs.
  • Die Anzahl der Eingriffe / Zugänge / Verkehre in den Sterilbereich ist so weit wie möglich zu minimieren. Bewegungen im Sterilbereich können Luftströmungen beeinflussen, Wirbel schaffen, den Schleier steriler Luft im Durchgriffsbereich stören.
  • Zellkulturreagenzien oder Gefäße, in denen sich Zellkulturen befinden, dürfen niemals außerhalb des Sterilbereichs geöffnet werden.
  • Wo irgend möglich sollten Pipetten und Pipettenspitzen mit Filter verwendet werden, um Verschleppungen oder Kontaminationen durch Aerosole zu vermeiden.
  • Im Bereich der steril durchzuführenden Arbeiten ist die Straßenkleidung entweder gegen Reinraumkleidung oder mindestens geeignete, saubere Schutzkleidung zu tragen. Straßenschuhe sind im Reinbereich tabu.
  • Im Reinraum sind Husten & Niesen ohne NMS tabu. Die Nase putzt man besser „draußen“.
  • Haut ist ein Träger von Kontaminationen oder kann kontaminiert werden. Das Tragen von Einmalhandschuhe ist für viele Tätigkeiten vorgeschrieben. Das „richtige“ Tragen muss gelernt werden, sonst hinterlässt es Spuren.
  • „Richtiges“ Atmen ist Pflicht. Niemals in einen Sterilbereich, einen Inkubator oder einen Tiefkühllagerbereich hinein atmen oder sogar sprechen.
  • Zellkulturen sind regelmäßig zu Beginn einer Arbeit zu mikroskopieren, um so Identität, Reinheit, Dichte und Vitalität oder eine Veränderung auch nur eines dieser Parameter bewerten zu können. Schon die Änderung der Medienfarbe oder Transparenz kann wichtige Hinweise geben.
  • Soweit vorhanden, sollte die mikroskopische Beurteilung mit Phasenkontrastunterstützung erfolgen. (Dringend angeraten)
  • Kontaminationen oder minderwertiges Zellkulturserum offenbart sich oft früh durch Partikelbildung. Gerichtete Bewegung oder Zilienschlag in Verbindung mit kleinen „Teilchen“ sind meist ein Hinweis für bakterielle Kontamination, aber nicht immer äußern sich Kontaminationen auf diese Weise. Pilze, Hefen, Mycoplasmen bleiben so zunächst oft unentdeckt.
  • Kreuzkontamination von Zellkulturen kann mit der Bildung von Aerosolen durch gemeinsame oder zu unmittelbar aufeinander folgende Handhabungen von Zelllinien im Sterilbereich beginnen. Zelllinien sind darum regelmäßig geeignet zu testen. (STR)
  • Regelmäßige / Routinetests auf Kontamination mit Mycoplasmen sind zu implementieren. (Immer nach dem Auftauen und sonst alle 2 bis 3 Monate Kulturdauer)
  • Pimärzellkulturen sind oftmals Quelle von Kontaminationen und müssen getrennt von Dauerzelllinnien gehandhabt werden.
  • Zellkulturspitzen und Pipetten müssen nach jedem Kontakt mit einer Zellkultur gewechselt werden. Am besten eigene Mediengebinde für jede Zelllinie verwenden.
  • Jeder Wechsel der zu handhabenden Zelllinie / -kultur sollte durch eine komplette erneute Vorbereitung des Sterilbereichs – inklusive Wechsel der Handschuhe – vorbereitet werden.
  • Zelllinien zeigen mit zunehmender Kulturdauer und oft in Folge eines Auftauvorgangs genetische Veränderungen, die von Änderungen der Epigenetik über Chromosomenbrüche bis zu „Entartungen“ durch Zugewinn neuer Eigenschaften führen können. Diese Veränderungen können sich sich phänotypisch wie auch biochemisch bemerkbar machen. Meist spalten sich die Eigenschaften auf und es entsteht Vielfalt wo zuvor Einheitlichkeit war.
  • Da die Diversifikation mit der Kulturdauer zunimmt, sollten frühzeitig von ersten Passagen der Zellen Einfrierrückstellungen (am besten bei -196 °C über flüssigem Stickstoff) gebildet werden. Die Zahl der absolvierten Passagen einer Zelllinie ist dabei sinnvollerweise anzugeben (in der Datenbank).
  • Zellen sind stets schonend zu behandeln. Dies bedeutet zum Beispiel, dass hohe Strömungsgeschwindigkeiten oder Druckunterschiede beim Pipettieren ebenso zu vermeiden sind wie schnelle Temperatur- oder pH-Wertänderungen.
  • Insbesondere adhärent wachsende Zellen nehmen ruppigen Umgang durch kräftiges Schütteln des Kulturgefäßes, wiederholtes Pipettieren der Zellsuspension etc. übel.
  • Zentrifugieren bei hohen g-Werten führt gerne zu untypischen selten schonend zu lösenden Verklumpungen der Zellen.
  • Suspensionen adhärent wachsender Zellen sind am besten so anzuimpfen, dass die Suspension möglichst bald gleichmäßig auf der gesamten Kulturfläche verteilt wird.
  • Die spezifische Dichte der meisten Zellen ist größer als die des Kulturmediums, darum sammeln sich Zellen gerne am Boden des Gefäßes. Zur Herstellung einer gleichmäßigen Suspension sollte die Zellen durch mehrfaches Aufnehmen mit einer Pipetten, die eine weite Öffnung hat, gemischt werden.
  • Zellkulturen, die in Petrischalen oder Kulturflaschen mit ebenem Boden inkubiert werden, nehmen Resonanzen gerne auf und bilden Zellrasen mit verdichteten Arealen an den Resonanzknoten.

Alle Leitsätze, Regeln und Vorgaben nutzen nur, wenn sie gelebt werden. Gelebt werden Leitsätze nur, wenn sie einleuchtend und anwendbar sind. Leitsätze sollten darum stets auf die konkreten Bedürfnisse, rechtlichen Vorgaben und die umsetzbare Praxis angepasst werden und diese wiedergeben.