Eine sterile Kultur pflanzlicher und tierischer Zellen kann schon auf einem sehr niedrigen Ausrüstungsniveau erfolgreich durchgeführt werden. Mit den Anforderungen an
- Kulturdauer,
- Kontaminationserkennung und -vermeidung,
- Reproduzierparkeit von Ergebnissen,
- Vermeidung der Gefährdung von Arbeitenden wie Umgebung,
- Zeiteinsatz und
- Planbarkeit
steigen die Anforderungen an Labor und Ausstattung ebenso wie an Schulung und Dokumentation.
Die Anforderungen sind nicht allgemeingültig abschließend formulierbar sondern unterliegen den Anforderungen der jeweiligen Vorhaben, gesetzlichen Regelungen und dem jeweiligen Stand der Erkenntnis. Im Rahmen ihrer „OECD Series on Good In Vitro Method Practices (GIVIMP)“ veröffentlicht die OECD https://doi.org/10.1787/20777876 eine Reihe von Dokumenten zu denen auch ein Dokument zur Guten Zellkulturpraxis gehört.
Aus dem Bestand der ECACC ist das folgende Video entnommen. https://www.youtube.com/watch?v=CA5fVLK5zAE
1. Cell culture laboratory and equipement overview
Generelle Anforderungen formuliert aus dem Video:
Räumlichkeiten:
- Tätigkeiten im Zellkulturlabor (ZK) sollten ausschließlich auf die Nutzung für Zellkulturarbeiten beschränkt sein
- Zelllinien können ein biologisches Sicherheitsrisiko darstellen. Entsprechende Anforderungen sind vor Beschaffung und Umgang zu erfüllen. Mindeststandards zu Dokumentation un Risikoabschätzung sind einzuhalten
- Zur Vermeidung einer Risikoverbreitung durch Aerosole sollte das ZK mit realtivem Unterdruck gegenüber der Umgebung betrieben werden.
- Alle Oberfläche im ZK sollen glatt, leicht zu reinigen und unempfindlich gegenüber Chemikalien / Reinigungsmitteln sein. Übergänge an Ecken sollten gerundet ausgeführt sein.
- Fenster sollten versiegelt, müssen mindestens dicht sein
- In Bereichen in denen flüssiger Stickstoff gehandhabt wird soll das Bodenmaterial widerstandsfest / rissfest gegenüber thermischen Belastungen (sehr tiefe Temperaturen bis -196°C) sein
Reinraumwerkbank – vertical flow
Von <a href=“//commons.wikimedia.org/wiki/User:Newbie~commonswiki“ title=“User:Newbie~commonswiki“>Newbie~commonswiki</a> – <span class=“int-own-work“ lang=“de“>Eigenes Werk</span>, Gemeinfrei, Link
Der Blick durch die Frontscheibe / den Schieber der Sicherheitswerkbank zeigt perforierte Bleche, deren Perforationen einerseits unmittelbar an der Front im Durchgriffsbereich und andererseits in den Blechen zur Rückwand des Arbeitsbereiches angebracht sind. Durch diese Löcher saugt ein großer Ventilator im inneren der Werkbank die aus dem Deckenbereich der Werkbank vertikal / senkrecht in den sterilen Arbeitsraum strömende Luft ab. Im unter den Blechen befindlichen Raum strömt die im vorderen Bereich angesaugte Luft in Richtung Rückseite der Reinraumwerkbank. Insbesondere die im Vorderbreich angesaugte Luft enthält bei geöfnetem Schieber auch Partikel (Abrieb vom Kittel, Hautschüppchen, Staub etc.) und zuweilen auch eine Pipettenspitze oder was auch immer durch die Perforation unter die Bleche gelangt. Auch Flüssigkeiten von der Oberflächendesinfektion der Bleche oder Aerosole und Tröpfchen gelangen in diesen Bereich. Der Raum unter den Blechen ist darum wöchentlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethanol) zu reinigen.
Die dargestellte Reinraumwerkbank besitzt zudem eine eingebaute UV-Lampe zur Desinfektion des Arbeitsraumes. Eine vollständige Desinfektion mittels UV-Licht ist nicht möglich, denn das Licht ist nur in den Bereichent wirksam gegen bakteriealle oder andere Kontaminationen wirksam, die es erreicht. Beispielsweise die Bereiche unterhalb der Bleche der Arbeitsfläche entfaltet es ebensowenig Wirkung wie in der Oberseite des Arbeitsbereiches um die HEPA-Filter und deren perforierte Bleche herum. Ist ein Brenner im Arbeitsraum installiert, wird auch dessen Stellfläche sicher nicht durch das UV-Lich kontaminiert. Es ist darum besser, nicht auf die Wirkung des UV-Lichts zu vertrauen.
Frontscheibe außen, Innenraum und zu-/wegführende Leitungen Leitungen sollten in den Hygieneplan des Labors aufgenommen werden.
Ein Video des ECACC zur Reinraumwerkbank: 3. The microbial safety cabinet and its use – https://www.youtube.com/watch?v=xADw5-VEe04
Aufgabe:
- Fassen Sie die wesentlichen Umgangshinweise in einer Arbeitsanweisung zusammen. Diese sollte Teil einer Standardarbeitsanweisung sein. Eine regelmäßige externe Überprüfung der Funktionalität wie Strömungsgeschwindigkeit und Partikelfreiheit der Luft ist verpflichtend. Die in der Reinraumwerkbank gehandhabten Zelllinienen und mögliche Gefährdungen für Wartungspersonal sind zu dokumentieren.
Der Zellkulturbrutschrank mit CO2-Begasung – Edelstahl, tiefgezogen
Von <a href=“//commons.wikimedia.org/wiki/User:Shinryuu“ title=“User:Shinryuu“>Shinryuu</a> – <span class=“int-own-work“ lang=“de“>Eigenes Werk</span>, Gemeinfrei, Link
Der Zellkulturbrutschrank bildet das Herz des Zellkulturlabors. Die meiste Zeit befinden sich die Zellen in dieser Umgebung. Durch geeignete Maßnahmen wird eine konstant hohe relative Luftfeuchtigkeit erreicht. Sie beträgt üblicherweise über 95 % und sorgt dafür, dass der Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung in Petrischalen, Mikrotiterplatten und Zellkulturflaschen begrenzt wird. Andererseits sorgt dies in einer mit 37 °C warmen Umgebung für optimale Entwicklung möglicher Kontaminationen, wie sie auf den Lochblechen durch Anheftungen oder Verschütten entstehen können. Einige Labors bevorzugen deshalb ein inneres, weiteres Kontainment, eine Kunststoffbüchse mit einem am Boden der Unterschale befindlichen Raster, das hälftig mit Kupfersulfatlösung gefüllt wird. Wieder andere Laboratorien setzen auf Kupfer als Werkstoff für den Brutraum. In jedem Fall mindert Kupfer die Kontaminationsgefahr signifikant. Eine Aufnahme des Brutschranks in den Hygieneplan des Labors ist dennoch unvermeidlich, denn er ist regelmäßig zu reinigen und zu überprüfen. Weitere Sicherheitsfunktionen eines Brutschrankes können in einer Temperierungsfunktion bestehen, die eine wirksame Sterilisation des Innenraums im Gefahrenfall vorsieht.
Inversmikroskop mit Phasenkontrast
Von Zephyris aus der englischsprachigen Wikipedia, CC BY-SA 3.0, Link
In Kultur befindliche Zellen wachsen oft adhärent und befinden sich dann am Boden von Zellkulturflasche, Mikrotiterplattenvertiefung oder Petrischale. Für die Standardmikroskopie sind sie damit oftmal nicht darstellbar, weil der Arbeitsabstand zwischen Objektiv und darzustellender Zellen den verfügbaren Arbeitsabstandabstand des Objektivs überschreitet. Dies trifft insbesondere für höhere Vergrößerunge >10x zu. Durch die Umkehrung des Lichtweges befindet sich die Lichtquelle des Invermikroskops oberhalb des zu betrachtenden Gutes. Dieser Abstand ist in weiten Bereichen irrelevant solange das Licht parallel auf das Untersuchungsgut strahlt. Petrischale, Objektträger, Mikrotiterplatte oder Kulturflasche mit den wachsenden Zellen findet in gewohnter Weise auf dem Kreuztisch Platz. Da die Objektive unterhalb des Kreuztisches angebracht sind, muss das durch das Untersuchungsgut fallende Licht seinen Weg von der Lichtquelle, durch das Untersuchungsgut, in das Objektiv und von dort weiter über Prismen im unteren Teil des Inversmikroskops bis hinauf in die Okulare finden. Der Strecke vom Untersuchungsgut bis zur Linse des verwendeten Objektives beschreibt den Arbeitsabstand. Auch in Suspension befindliche Zellen können mittels Inversmikroskop bewertet werden. Da die spezifische Dichte der meisten Zellen geringer als die des Zellkulturmediums ist, sammeln sich die Zellen auf dem Boden der Kultureinheit. Fettzellen hingegen lassen sich im Invermikroskop nicht einfach betrachten. Hier empfiehlt sich die Kultur im hängenden Tropfen und die Nutzung des Standardmikroskops.
Für Zellkulturarbeiten bewehrt sich die Verwendung des Phasenkontrastes, denn doppelbrechende Strukturen wie Zilien und Geißeln fallen hier besonders auf, was die Erkennung von Kontaminationen erleichtert.
Aufgabe:
- Skizzieren Sie den Lichtweg eines Inversmikroskops.
- Beschreiben Sie die Funktion der Phasenkontrasteinheit eines Mikroskops. Welche augenfällige, besondere Ausrüstung benötigt das Mikroskop für die Phasenkontrastdarstellung?
Erkennung bakterieller Kontamination mit dem Phasenkonstrastmikroskop
Moving Bacteria in Cell Culture – Ein Eppendorf-Video – https://www.youtube.com/watch?v=zXPiZ2XBUzE
Bakterien sind klein verglichen mit eukaryotischen Zellen. Oft findet sich auch Zelldebris in Kulturen. Viele kontaminierende Bakterienarten machen sich in einer Senkung des pH-Wertes im Zellkulturmedium und / oder durch eine Trübung des Mediums bemerkbar.
Mycoplasmen sind Parasiten eukaryotischer Zellen. Sie sind kleiner als gewöhnliche Bakterien und meist nicht unmittelbar lichmikroskopisch zu erfassen, weshalb spezielle Färbetechniken zu ihrem Nachweis entwickelt wurden.
Mycoplasma Detection: Hoechst DNA Staining – Video – https://www.youtube.com/watch?v=8xvjGSQS2Qg
Mycoplasmen können zu Schäden an der DNA der Wirtszellen führen. Sie parasitieren nicht nur am Energiestoffwechsel sondern auch an essentiellen Aminosäuren und mehr. Ihr Nachweis erfordert (wie im Video dargestellt) oft eine Fluoreszenzeinrichtung am Mikroskop.
Generell gilt: Eine Hauptquelle von Kontaminationen bewegt sich autonom im Zellkulturlabor: Der handelnde Mensch. Bakterien und Mycoplasmen sind meist Teil der Haut- und Nasenflora. Das Atmen in Richtung auf und in einen geöffneten Brutschrank wird ebenso zum Problem wie das Atmen in Richtung auf die Zellkulturgefäße auf dem Inversmikroskop. Die Reinraumwerkbank mit vertikaler Luftströmung und Schieber als Schutz und Trennung zwischen Sterilbereich und Mensch ist ein sehr wirksamer Schutz bei korrektem Umgang mit Zellen, Medien und Dingen im sterilbereich.
Besonders schwer zu erkennen sind jedoch Kontaminationen durch andere Zelllinien.