Impftechniken

2.5 Impftechniken

Unter „Impfen“ versteht man in der Mikrobiologie das Einbringen von Mikroorganismen (MO) in ein Medium, in dem diese zuvor nicht enthalten waren und sich dort vermehren. Entsprechend lassen sich beimpfen:

  • Nährboden mit Bakterien, Pilzen oder Gewebekulturzellen
  • Bakterien mit Bakterienviren
  • Zellkulturen mit Viren, Bakterien und Pilzen
  • Höhere Organismen mit Mikroorganismen oder anderen höheren Organismen

Zum Überimpfen werden von Mikroorganismen werden Impfösen, -nadeln, Spatel und Pipetten benutzt. Das Prinzip ist dabei stets, dass mit dem sterilen Impfgerät eine kleine Menge MO aufgenommen – ohne Kontamination – auf den sterilen Nährboden übertragen und dort meist noch auf größerer Fläche ausgebreitet wird.

Mögliche Impftechniken: 

  1. Verteilung des Impfmaterials in einem flüssigen oder auf einem festen Nährboden mit der Impföse, die MO werden einem flüssigen oder festen Nährboden entnommen.
  2. Übertragung einer abgemessenen Menge Mikroorganismensuspension aus einem Kulturgefäß in ein anderes mittels Messpipette.
  3. Überimpfen eines MO aus einem Kulturröhrchen in ein anderes mit Hilfe der Impföse.

Allgemeine Hinweise zur Beimpfung von Kulturen:

  • Bunsenbrenner muss direkt vor der arbeitenden Person stehen
  • Alle Gerätschaften bereitlegen, rechts Impfgeräte im Ständer, sterile Pipetten, Pipettierhilfe; links Kulturen und Nährböden ggf. im Reagenzglasständer, Desinfektionsbad für die Pipetten (=rote Eimer); bei Linkshändern Anordnung umgekehrt
  • Vorher alles beschriften (Datum, Nährboden, Mikroorganismus, Versuch, Name), Platten werden am Rand auf der Unterseite beschriftet nicht die Deckel beschriften, da diese vertauscht werden können
  • Arbeitsplatz mit 70%igem Alkohol säubern
  • Gefäße nicht ruckartig öffnen (Luftwirbel), sondern vorsichtig durch Drehen Verschlusses, Platten nur einen Spalt weit öffnen
  • Ruhig und zügig arbeiten
  • Die Agar- Oberfläche nicht verletzen

Alle beschriebenen Impfmethoden sind für Rechtshänder beschrieben. Linkshänder müssen in den Arbeitsabläufen rechts und links vertauschen.

1) Verteilung des Impfmaterials in oder auf einem Nährboden mit Hilfe der Impföse

  1. Fest/ Flüssig- Überimpfung
    • Impföse ausglühen
    • Kulturgefäß mit dem festen Nährboden soweit wie nötig öffnen
    • Impföse abkülen lassen und etwas MO- material (=Inokulum) von einer Kolonie entnehmen
    • Platte schließen
    • Kulturröhrchen dem Ständer entnehmen und öffnen, dabei die Kappe mit dem kleinen Finger der rechten Hand abziehen und nicht ablegen
    • Impföse mit dem Inokulum kurz in die zu beimpfende Nährlösung eintauchen um es zu befeuchten
    • Dann das Impfmaterial an der Gefäßwand dicht oberhalb des Flüssigkeitsspiegels gut verreiben
    • Kulturröhrchen soweit kippen, dass das Impfmaterial von der Kulturflüssigkeit überspült wird, jetzt das Material vorsichtig mit der Impföse verteilen
    • Impföse aus dem Kulturröhrchen herausziehen, Öffnung des Gefäßes und Verschlussrand abflammen und schließen
    • Inokulum mit der Nährlösung vermischen; entweder durch Rollen des Röhrchens zwischen den Handflächen oder durch Benutzung eines Reagenzglasmischgerätes (Vortex)
  2. Flüssig/ Fest- Überimpfung auf Schrägagar oder Nährbodenplatte
    • Impföse ausglühen und abkühlen lassen
    • Kulturröhrchen mit der Flüssigkultur öffnen (s.a))
    • Impföse in die Flüssigkultur eintauchen um die Öse zu benetzen
    • Impföse aus dem Gefäß herausziehen und das Gefäß nach Abflammen verschließen
    • Schrägararröhrchen aus dem Ständer entnehmen und steril (in der Nähe der Flamme) öffnen (hierbei wieder die Kappe mit dem kleinen Finger der rechten Hand festhalten
    • Impföse mit dem Inokulum vorsichtig bis zum Grund des Kulturröhrchens führen ohne dabei die Gefäßwände zu berühren
    • Impföse ca. 1 cm vom Gefäßboden entfernt (außerhalb des Kondenswassers) auf den Agar aufsetzen; dann die Öse langsam und ohne Druck in einer Schlangenlinie zur Röhrchenöffnung hin über den Agar bewegen
    • Impfstrich kurz vor Agarende beenden; Gefäßwand nicht berühren, Agaroberfläche nicht verletzen
    • Impföse ausglühen
    • Bei der Überimpfung aus einer Flüssigkultur auf eine Nährbodenplatte wird die Impföse ebenfalls in einer Schlangenlinie mit engen Windungen über den Agar geführt; diese Art des Impfstriches wird „einfacher Ausstrich“ bezeichnet.

Es besteht auch die Möglichkeit, dass die Nährmedien die gleiche Konsistenz haben:

Fest/ fest   bzw. Flüssig/ Flüssig – Überimpfung  =  Platte / Platte oder Schrägagar/ Schrägagar oder Kulturröhrchen flüssig / Kulturröhrchen flüssig   werden durch geführt indem die unter a) und b) angegebenen Arbeitsschritte entsprechend kombiniert werden.

2) Übertragung einer genau abgemessenen Menge an Mikroorganismensuspension aus einem Kulturgefäß in ein anderes mittels Messpipette

  • Material bereitstellen
  • Flüssigkultur gut durchmischen (Schraubverschlüsse schütteln, Kolben schwenken, Kulturröhrchen mit Vortex mischen); Verschluss darf nicht feucht werden
  • Verschlüsse an den Gefäßen lockern
  • Pipettendosen an beiden Enden fassen (Deckel nach rechts) und durch vorsichtiges Rütteln die Pipetten nach vorne zum Deckel hin bewegen
  • Deckel der Büchse abziehen und mit der Öffnung nach unten in der linken Hand halten
  • Mit dem kleinen Finger der rechten Hand die benötigte Pipette etwas herausschieben und dann ohne die übrigen Pipetten zu berühren herausnehmen, indem die Pipette mit dem kleinen Finger oder Ringfinger umschlossen wird
  • Die übrigen Pipetten in die Dose zurück gleiten lassen; Dose offen liegen lassen
  • Pipette in die Pipettierhilfe einstecken, dabei Pipette möglichst weit oben anfassen
  • Kulturgefäß in die linke Hand nehmen (nicht am Stopfen anfassen), kurz durch die Flamme ziehen und den Verschluss mit der rechten Hand abnehmen; der Verschluss kann zwischen kleinem Finger und dem Handballen oder zwischen Zeige- und Mittelfinger gehalten werden, der Verschluss darf nicht abgelegt werden, ggf. kann das Gefäß nochmals geschwenkt werden und nochmals durch die Flamme ziehen
  • Pipette durch die Flamme ziehen
  • Pipette ohne Berührung des Gefäßrandes in das Gefäß bringen und mit der Pipettenspitze tief in die Flüssigkeit eintauchen, allerdings darf die Spitze nicht den Boden berühren
  • Pipette bis kurz über die Nullmarke voll saugen, dann aus der Flüssigkeit herausziehen, an der Innenwand anstellen (Pipette senkrecht – Gefäß schräg) und bis zur gewünschten Marke ablaufen lassen
  • Pipette aus dem Kulturgefäß vollständig herausziehen
  • Öffnung des Kulturgefäßes abflammen, Verschluss wieder aufsetzen und Gefäß wegstellen
  • Jetzt das zu beimpfende Gefäß mit der linken Hand nehmen und öffnen (s.o.) in dieser Zeit darf die Pipette keine Flüssigkeit verlieren
  • Pipette in das leicht schräg gehaltene Gefäß einführen und die Spitze an der Gefäßwand kurz oberhalb des Flüssigkeitsspiegels absetzen
  • Pipette auslaufen lassen
  • Pipette aus dem Gefäß ziehen
  • Gefäßöffnung abflammen, verschließen, durchmischen
  • Pipette vorsichtig aus der Pipettierhilfe ziehen und im „Roten Eimer“ ablegen
  • Verschlüsse der Gefäße fest andrücken / vollständig zuschrauben ggf. gründlich durchmischen

Schemata für Impftechniken

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