40 nm Unterschied sind viel

Die folgende Abbildung zeigt das für das menschliche Augen sichtbare Spektrum des Lichts. Sie wurde aus de.wikipedia.org/wiki/Spektralfarbe entnommen.

Spektralfarben

Die Anwendung von TMB-Substrat in einem ELISA zeigt die im vorangegangenen Beitrag beschriebene grünlich-bläuliche Farbe im neutralen Milieu.

DSC_0151b

Durch Zugabe von Schwefelsäure verändert sich die Farbe radikal.

DSC_0153b

Sie erscheint gelb. Blaues Licht wird also absorbiert.

Die Fotometrie verdeutlicht dieses Verhalten. Wird die gelb erscheinende Lösung durch einen Spektralfilter mit einer Wellenlänge von 450 nm betrachtet zeigt sich die Absorption des Lichts deutlicher

L450 nm Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3
 A  0,103 0,098 0,187
 B  0,390  0,372  0,175
 C  0,372  0,312  0,267
 D  0,335  0,297  0,283
 E  0,276  0,292  0,411
 F  0,207  0,206  0,377
 G  0,138  0,137  0,480
 H  0,140  0,118  0,126

als bei Betrachtung durch einen Farbfilter von 492 nm Wellenlänge.

L492 nm Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3
 A  0,050 0,049 0,067
 B  0,101  0,099  0,063
 C  0,099  0,088  0,077
 D  0,090  0,087  0,082
 E  0,080  0,090  0,100
 F  0,068  0,068  0,096
 G  0,057  0,056  0,114
 H  0,057  0,051  0,056

Die Differenzbildung ermöglicht sogar die Auswertung des Tests ohne störende, unspezifische Hintergrundextinktionen. Ein Fettfinger oder eine Trübung absorbieren Licht aller Wellenlängen. Gemeinsame Extinktionsanteile aber eliminiert die Differenzbildung.

L450nm – L492nm Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3
 A  0,053 0,049 0,120
 B  0,289  0,273  0,112
 C  0,273  0,224  0,190
 D  0,245  0,210  0,201
 E  0,196  0,202  0,311
 F  0,139  0,138  0,281
 G  0,081  0,081  0,366
 H  0,083  0,067  0,070

Zur Eliminierung der unspezifischen Anteile bietet sich noch eher eine Wellenlänge an, bei der die Absorption des Farbstoffes gegen Null tendiert. Hier sei auf den verlinkten Artikel zur Performance von TMB verwiesen.

Wenn ein Wellenlängenunterschied von „nur“ 40 nm schon vor allem unspezifische Signale einfängt, dann wird deutlich, dass eine optimale Auswertung des Tests nur bei möglichst genau passender Wellenlänge gelingt. Die Spezifität der Auswertung wächst.

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