Die folgende Abbildung zeigt das für das menschliche Augen sichtbare Spektrum des Lichts. Sie wurde aus de.wikipedia.org/wiki/Spektralfarbe entnommen.
Die Anwendung von TMB-Substrat in einem ELISA zeigt die im vorangegangenen Beitrag beschriebene grünlich-bläuliche Farbe im neutralen Milieu.
Durch Zugabe von Schwefelsäure verändert sich die Farbe radikal.
Sie erscheint gelb. Blaues Licht wird also absorbiert.
Die Fotometrie verdeutlicht dieses Verhalten. Wird die gelb erscheinende Lösung durch einen Spektralfilter mit einer Wellenlänge von 450 nm betrachtet zeigt sich die Absorption des Lichts deutlicher
| L450 nm | Spalte 1 | Spalte 2 | Spalte 3 |
| A | 0,103 | 0,098 | 0,187 |
| B | 0,390 | 0,372 | 0,175 |
| C | 0,372 | 0,312 | 0,267 |
| D | 0,335 | 0,297 | 0,283 |
| E | 0,276 | 0,292 | 0,411 |
| F | 0,207 | 0,206 | 0,377 |
| G | 0,138 | 0,137 | 0,480 |
| H | 0,140 | 0,118 | 0,126 |
als bei Betrachtung durch einen Farbfilter von 492 nm Wellenlänge.
| L492 nm | Spalte 1 | Spalte 2 | Spalte 3 |
| A | 0,050 | 0,049 | 0,067 |
| B | 0,101 | 0,099 | 0,063 |
| C | 0,099 | 0,088 | 0,077 |
| D | 0,090 | 0,087 | 0,082 |
| E | 0,080 | 0,090 | 0,100 |
| F | 0,068 | 0,068 | 0,096 |
| G | 0,057 | 0,056 | 0,114 |
| H | 0,057 | 0,051 | 0,056 |
Die Differenzbildung ermöglicht sogar die Auswertung des Tests ohne störende, unspezifische Hintergrundextinktionen. Ein Fettfinger oder eine Trübung absorbieren Licht aller Wellenlängen. Gemeinsame Extinktionsanteile aber eliminiert die Differenzbildung.
| L450nm – L492nm | Spalte 1 | Spalte 2 | Spalte 3 |
| A | 0,053 | 0,049 | 0,120 |
| B | 0,289 | 0,273 | 0,112 |
| C | 0,273 | 0,224 | 0,190 |
| D | 0,245 | 0,210 | 0,201 |
| E | 0,196 | 0,202 | 0,311 |
| F | 0,139 | 0,138 | 0,281 |
| G | 0,081 | 0,081 | 0,366 |
| H | 0,083 | 0,067 | 0,070 |
Zur Eliminierung der unspezifischen Anteile bietet sich noch eher eine Wellenlänge an, bei der die Absorption des Farbstoffes gegen Null tendiert. Hier sei auf den verlinkten Artikel zur Performance von TMB verwiesen.
Wenn ein Wellenlängenunterschied von „nur“ 40 nm schon vor allem unspezifische Signale einfängt, dann wird deutlich, dass eine optimale Auswertung des Tests nur bei möglichst genau passender Wellenlänge gelingt. Die Spezifität der Auswertung wächst.