PHB geht in die Zielgerade

OpenDIN_TestKeine Ziel- sondern eine Kalibrationsgerade der Polyhydroxybuttersäure (PHB), entstanden am Machertag im März. Zuallererst: Die Technik-Garage bedankt sich herzlich bei den Schulen Dr. Kurt Blindow für die Möglichkeit der Nutzung der Schullabors an diesem Machertag!

DSC_0406Ein Keller voller Labors. Ein Traum für Macher. Ziele des Machertages:

  • Lösen von PHB in Chloroform.
  • Umsetzung von PHB in Crotonsäure.
  • Entwicklung einer Kalibrationsgerade.
  • Ermittlung einer unteren Bestimmungsgrenze.
  • Schätzung eines Messbereichs für PHB.

Zur Verfügung steht käuflicher PHB-Standard, eine Vorschrift aus dem Jahr 1961, technische Kompetenz und die erforderlichen Chemikalien (der Technik-Garage). Details zur Methode und Auswertung nach DIN sind demnächst auf dieser Webseite im Projektbereich über das Bioplastik zu finden. Zugleich diente der Versuch dazu, die für virtuelle Gemeinlabors konform zur DIN 17025 entwickelten intentionalen Verfahrensanweisungen zu testen.

DSC_0411 Im Rahmen der Untersuchung von in Lactobacillus aciduphilus eingelagertem Reservestoff des Bakteriums werden die Bakterien zunächst zerstört (mit Hilfe von Hypochlorid). PHB ist relativ inert, so dass es in den folgenden Reinigungsschritten (mit Ethanol und Aceton) nicht gelöst wird. PHB-Standard wird auf einer rückgeführten Waage eingewogen.
DSC_0415 Polyhydroxybuttersäure löst sich nicht in Wasser und auch in konzentrierter Schwefelsäure ist sie nicht löslich.
DSC_0413 Der Literatur nach ist PHB in Chloroform in einer Menge bis zu 42 g / L löslich. Leider löst sie sich nicht beim Raumtemperatur oder nur leicht erhöhter Temperatur (40°C), wie an der anhaltenden Trübung zu erkennen ist.
DSC_0410 Der Siedepunkt von Cholroform beträgt 61°C. Das Wasserbad wird auf eine Temperatur oberhalb von 61°C erhitzt (im Versuch 65°C).
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Unter Rückfluss löst sich die PHB innerhalb von etwa 10-40 Minuten, wenn es feinpulverig ist. Die untere Abbildung zeigt die klare Lösung von PHB in Chloroform.
DSC_0419 Das zur Hydrolyse vorgesehene mit konzentrierter Schwefelsäure Polymer wird im kochenden Wasserbad für >10 Minuten erhitzt. Nach dem ersten Erhitzen entsteht ein dunkle Phase oben auf der Säure,
DSC_0422 die sich nach Schütteln auf dem Vibrax homogen und klar in der Säure mischt. Die gesamte Lösung nimmt dabei eine dunklere Färbung an.
DSC_0428 Aus dem PHB-Hydrolysat entstehr eine erste Stammlödung durch eine 1:10-Verdünnung in konzentrierter Schwefelsäure. Dabei verliert sich die zunächst erkennbare Färbung der Lösung. Aus dieser Stammlösung 1 werden über Zwischenschritte geeignete Verdünnungen hergestellt, die die Kalibratoren bilden. Der Umgang mit der in konzentrierter Schwefelsäure PHB erfordert größte Umsicht. Vor dem Befüllen der Quarzküvette ist zunächst die zuvor bestimmte Lösung möglichst restlos zu entfernen. Die Zellstoffunterlage zeigt eine unmittelbare Reaktion / Zersetzung durch die konzentrierte Schwefelsäure, wie die Schwarzfärbung des Zellstoffs zeigt.

Der Regressionskoeffizient der Kalibration beträgt 0,9997. Die untere Bestimmungsgrenze liegt bei 0,605 µg / ml. Erkennbar an der Zunahme der Residuen vergrößert sich der Abstand der Messwerte zur Kalibrationsgeraden mit Zunahme der PHB-Konzentration. Die 10 Kalibratoren verteilen sich nicht äquidistant über den Messbereich. Für eine Validierung wären zudem vom unteren als auch der oberen Kalibrator Mehrfachbestimmungen vorzunehmen. Eine vollständige Validierung des Verfahrens ist vorgesehen, jedoch sollen alternative Methoden zur Bestimmung der PHB-Konzentration geprüft werden, denn:

  • der Umgang mit konzentrierter Schwefelsäure ist für Untersucher wie für die Technik mit hohen Risiken verbudnen.
  • die Bestimmung der PHB-Konzentration als Hydrolysat lässt keine Aussagen über die Verteilung der Kettenlängen des Polymers zu.
  • die Methode soll für die Automatisierte Probenvorbereitung und
  • die Verarbeitung der Proben im Autosampler optimiert werden.

Parallel zur Erstellung der Kalibrationsgeraden wurden (zum Teil gezeigt) Untersuchung bezüglich des finalen Reinigungsschrittes / Löslichkeit in Chloroform vorgenommen. Zusätzlich zur Untersuchung der Löslichkeit des PHB-Standards in Chloroform wurden Löslichkeit und Messbarkeit einer aufgearbeiteten und für ein Jahr bei -20°C im Tiefkühlschrank gelagerte Probe einer Bakterienkultur untersucht. Im Anschluss an das Lösen in Chloroform kann nichtlöslicher Rückstand abgetrennt werden. Das Chloroform der Lösung kann nach dem Überführen in einen sauberen Herzkolben entweder im Rotationsverdampfer oder Schliffstopfenreagenzglas abgezogen werden. Der verbleibende trübe Rückstand wird in konzentrierter Schwefelsäure aufgenommen und vor der fotometrischen Bestimmung bei 235 nm geeignet verdünnt. Die Bewertung der Kalibration erfolgt mit Hilfe der freien Programme DIN-Test und OpenDIN-Test mit Excel bzw. OpenCalc.

Es waren 7 Stunden, die sich gelohnt haben.  Wir freuen uns auf die kommenden Untersuchungen und Machertage.

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